濕熱滅菌柜使用滅菌的四個階段如下： 先是升溫準備階段。滅菌箱的夾克先進導入蒸汽，使夾克升溫到121的同時加熱夾克內部的空氣。作用于夾克升溫的內室升溫作用于蒸汽時，蒸汽接觸的內壁和內部空氣凝結而不成水。如果不升溫，熱蒸汽與冷內壁和空氣接觸會產生冷凝水，存在內腔溫度不均勻、滅菌物干燥度不充分等問題。
之后是升溫階段。可以用真空泵利用水流排出滅菌箱內的冷空氣，在達到負壓狀態的同時排出滅菌物內部的空氣。然后投入飽和熱蒸汽，迅速滲透到物體內部，即可獲得飽和蒸汽置換空氣的效果。重復這三次或四次，空氣置換會比較*，溫度會上升到121。
之后，是滅菌階段。滅菌階段，連續投入少量飽和蒸汽，排除部分蒸汽。內室溫度保持在121，內室壓力約為110KPa左右。在高溫和高壓的作用下，使微生物蛋白變性凝固失活達到滅菌要求。
最后是干燥階段。抽真空釋放內部蒸汽，然后補充過濾后的熱壓縮空氣。(滅菌柜有換熱器和除菌過濾器，壓縮空氣進入內腔先用除菌過濾器過濾，再用換熱器加熱進入設備內腔。如果不加熱，冷壓縮空氣就會進入內腔使蒸汽凝結成水，如果不過濾就會導入細菌，滅菌失敗。)在這里強調，干燥是與升溫幾乎相反的過程。
濕熱滅菌柜常用的幾種滅菌方法：
1、高壓蒸汽滅菌法：壓力蒸汽滅菌在專業壓力蒸汽滅菌器中進行，是一種普遍用于熱滅菌、效果可靠的方法。其優點是貫通力強，滅菌效果可靠，能殺滅所有微生物。
2、巴氏消毒法：利用熱量殺滅液體中病原菌和常見雜菌，同時不明顯損害其質量的消耗方法。巴斯德為消毒醇類而制作的故名。加熱61.1~62.8分鐘，或71.715~30秒鐘。常用于牛奶、酒類等的消毒。
3、流通蒸汽滅菌法：用100左右水蒸氣消毒。一般采用流通蒸汽滅菌器(其原理相當于我國蒸鍋)，加熱15至39分鐘，即可殺滅細菌繁殖體。消毒物品的包裝不要太大或太緊，以利于蒸汽的滲透。
4、煮沸法：100煮沸5分鐘，可殺滅一般細菌繁殖體。很多芽孢經過煮潮5~6小時就會死亡。向水中加入2%碳酸鈉，沸點達到105。既能促進芽孢的殺滅，又能防止金屬器生銹。煮沸法可用于飲水和一般器具(刀具、注射器等)的消毒。5、間歇滅菌法：利用多次重復流通蒸汽達到滅菌目的。一般采用流通蒸汽滅菌器，100加熱15~30分鐘，即可殺死其中的繁殖體；芽孢還留著。取出后在37的培養箱過夜，使芽孢發育成繁殖體，第二天再蒸一次。把這個堅持三次以上。本法適用于耐高溫營養素如血清培養基滅菌。
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